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新型氰化物中毒解毒剂二甲基三硫研究进展

时间:2019-03-27 17:00来源:毒理学杂志,2019,33(01) 作者:陈旭,佘仁东,陆荣 点击:
氰化物是一种常见的化工原料,在工农业生产中均有应用,亦是公认的剧毒化合物。由于氰化物中毒具有突发性、高致死以及进展快速等特点,为了应对意外氰化物暴露事件的发生,大量针对性


氰化物是一种常见的化工原料,在工农业生产中均有应用,亦是公认的剧毒化合物。由于氰化物中毒具有突发性、高致死以及进展快速等特点,为了应对意外氰化物暴露事件的发生,大量针对性的研究从未停止,包括氰化物中毒事故的发生模式[1]、应急医学诊治措施[2-3]、中毒病人的护理管理[4-5]、应急检测技术[6]、给药途径[7]以及特效药物开发等,其中抗氰药物的研发一直是应对职业中毒、火灾以及化学恐怖事件的研究重点[8-14],现有研究发现传统的抗氰药物(亚硝酸钠与硫代硫酸钠联合使用)易加重机体进一步缺氧,且硫代硫酸钠供硫效率较低;而新一代抗氰试剂盒(Cyanokit)的活性成分羟钴胺素则需在氰化物中毒后及时静脉注射,技术要求较高,现阶段尚缺乏可用于大规模人群救治的理想的抗氰药物[15-16]。二甲基三硫(DMTS)是一种天然来源的植物化学物,最近有研究发现DMTS有望成为新一代氰化物解毒剂[17],现就其解毒效果、剂型研发、生物样品的检测技术以及药代动力学参数等方面的研究现状作一综述,为国内研发新型氰化物解毒剂提供借鉴。

1 DMTS的理化特性及来源

DMTS是一种有机三硫化物,分子式为C2H6S3,相对分子质量为126.25,由2个二硫键(S—S)及2个甲基(—CH3)构成(图1)。由于其结构的(S—S—S)结构与醚基(C—O—C)结构相似,又被称为二甲基三硫醚。DMTS是一种无色至淡黄色的易挥发油状液体,具有强烈薄荷气味和浓烈的类似新鲜洋葱的辛香气味。沸点为58℃(15mmHg),微溶于水,溶于乙醇、丙二醇和脂类。


图1二甲基三硫结构式

DMTS本身是一种天然来源的植物提取成分,主要存在于新鲜洋葱、大蒜和西兰花等植物中,薤白、韭菜的挥发油中也被证实含有DMTS[18-19],此外,DMTS还被发现存在于发酵老化的食物(奶酪)和饮料(牛奶、啤酒、葡萄酒)中,也可来自细菌蛋氨酸的氧化降解产物[20]

2 DMTS的抗氰效果评价

2. 1 体外实验

在pH为7.4的反应体系中,以硫代硫酸钠溶液为参照,将不同浓度的DMTS溶液200μl与250mmol/L氰化钾200μl在10mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中混合反应5min,最终用硝酸铁分光光度法测定有色络合物的吸光度,吸光度值越大,说明供硫化合物(DMTS或硫代硫酸钠)将氰化物转化为硫氰酸盐的体外转化率越高。结果提示在含有硫氰酸盐生成酶(Rh)和pH为7.4的体外环境中,DMTS将氰化物转变成硫氰酸盐的效率大约是硫代硫酸钠的40倍,而在无Rh时,DMTS在体外转化氰化物的效率则是硫代硫酸钠的80倍左右。由此可见,在有或无Rh的条件下DMTS均比硫代硫酸盐更有效地将氰化物转变成硫氰酸盐。并且硫代硫酸钠具有更高的Rh依赖性,因为硫代硫酸钠不易快速透过细胞膜和线粒体膜与Rh结合反应,而具有脂溶性的DMTS,更易透过细胞膜与血脑屏障[21-22]。因而DMTS将是一种氰化物解毒的更为高效供硫化合物。

2. 2 体内实验

选用雄性CD-1小鼠为实验动物,皮下注射1mg/ml氰化钾溶液30s后,肌肉注射100mg/kg·bw的DMTS或硫代硫酸钠,注射完毕后观察1h,并24h内定时观察氰化物致死情况。评价指标为解毒效能比(APR),其计算公式为:APR=使用解毒剂DMTS或硫代硫酸钠组的氰化钾LD50/未用解毒剂的氰化钾LD50。结果显示,100mg/kg·bw硫代硫酸钠时APR为1.1,同样剂量的DMTS的APR是3.3。该结果表明和同样剂量的硫代硫酸钠相比,DMTS对氰化钾染毒小鼠显示出更好的解毒作用[22]

3 DMTS的剂型制备研究

3. 1 DMTS的剂型制备

由于DMTS是一个脂溶性化合物,选择良好的溶剂对剂型制备至关重要,为增加DMTS水溶性,Kovacs等[22]考察比较了3种环糊精[羟丙基-β-环糊精(HPβCD)、甲基化β-环糊精(RMβCD)和羟丙基-γ-环糊精(HPγCD)]的增溶作用,实验数据显示DMTS的溶解度随着环糊精浓度(0.01~0.12mol/L)的增大逐渐升高,在0.12mol/LRMβCD中的溶解度最高,大约是水中的90倍;DMTS在乙醇、聚乙二醇200(PEG-200)、聚乙二醇300(PEG-300)以及丙二醇4种溶剂(各溶剂浓度分别为0%、25%、50%、75%和90%)中溶解度也出现随着溶剂浓度的增高呈上升趋势,特别在乙醇浓度大于50%时,DMTS溶解度的变化尤为明显,在90%乙醇溶液中溶解度大约是水中溶解度的1538倍,将乙醇与其它3个溶剂1∶1混合使用时,DMTS在混合溶剂中的溶解度与单纯的乙醇助溶相比变化不大,但可减少乙醇的用量,降低高浓度溶剂的毒性;使用表面活性剂[聚氧乙烯蓖麻油EL、蓖麻聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40、胆酸钠、去氧胆酸钠和聚山梨酯80(PS80)]的溶解度实验中,表面活性剂可以增大DMTS的溶解度,单独使用PS80中的溶解度最高,DMTS在20%的PS80中的溶解度是在水中的735倍,以上溶解度试验均是先用上述增溶剂溶解DMTS,室温放置1周达到饱和,再5000r/min离心5min后取上清用GC-MS或HPLC测定DMTS浓度,上述实验数据为DMTS制备成各种剂型奠定了良好基础。为评价DMTS新剂型的稳定性,Bartling等[23]选用了3个独立实验室分别用15%聚山梨酯80(PS80)配制DMTS溶液(50mg/ml),结果发现在室温条件下(25℃)储存29周后,3个实验室来源的DMTS浓度均不同程度地降低了36%~58%,说明制备过程和储存过程中因为蒸发和析出等因素可造成DMTS的丢失;在不同pH值条件下,DMTS浓度变化则不明显,提示pH值对DMTS的稳定性影响不大。用聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)制备的胶束包裹DMTS(mDMTS),不仅能降低DMTS蒸发速率,还可消除注射部位肌肉坏死现象;当DMTS在PEG2000-DSPE中形成胶束后,

其溶解度可达2mg/ml,如按1ml/100g·bw的注射量来看,使用剂量可高达20mg/kg·bw,完全满足达到解毒目标的解毒剂量。小鼠肌肉注射12.5m/kg·bwmDMTS的APR为2.09,解毒效果十分显著。因而以PEG2000-DSPE作为DMTS胶束给药系统的辅料是提高DMTS溶解度、稳定性和功效的有效选择[24]

3. 2 肌注DMTS剂型的实验研究

以15%的聚山梨脂80(PS80)为助溶剂,配制50mg/mlDMTS溶液,观察其对氰化钾染毒CD-1雄性小鼠的解毒能力。结果发现同为100mg/kg·bw的处理剂量时,硫代硫酸钠与DMTS的APR分别为1.1 和3.4,当硫代硫酸钠与DMTS剂量提高到200mg/kg·bw时,APR分别为增加到1.3和4.1。但选用20%的PS80时,100mg/kg·bwDMTS APR则为3.2,提示提升PS80用量并不能增强解毒效果[22]。Deleon等[25]选用35~40d的雄性CD-1小鼠25%研究了司盘80(Span-80)和75%吐温80(Tween80)配制肌注DMTS的抗氰效果,当给予8mg/kg·bw KCN后,13只受试小鼠中有10只出现翻正反射丧失,9只抽搐,5只动物死亡,而给予100mg/kg·bw DMTS的处理组,只有1只出现抽搐和丧失翻正反射现象并死亡。可见DMTS不仅可减轻氰化物毒性症状(呼吸窘迫、抽搐和震颤等),还能显著增加存活率。与此同时,模拟实际场景的HCN吸入实验数据也证实DMTS可延长生存时间,降低死亡率[25]。这些配方及实验结果为开发适合大规模氰化物中毒事件的肌注剂型解毒剂提供了基础。

4 生物样品中DMTS的检测方法及其应用

DMTS的测定方法通常采用高效液相色谱或气相色谱-质谱联合(GC-MS)等灵敏度较高的仪器法[26-29],但这些方法不能直接用于低含量且不同基质来源生物样品的测定,因此,对生物样品中DMTS准确含量的检测必须依赖合适的样品前处理技术。Manandhar等[28]建立了以搅拌棒吸附萃取(SBSE)为样品前处理技术为手段,采用GC-MS检测兔全血样品中DMTS含量。因搅拌棒的PDMS层能有效吸附浓缩血液中DMTS,该法对DMTS的检测限为0.06μmol/L,线性范围为0.5~100μmol/L,相关系数(R2>0.998);准确度和精密度较好,符合美国食品药品监督理局(FDA)关于方法验证指南中要求。但低、中和高浓度DMTS的回收率分别为66%、63%和59%,明显低于基本要求的80%,这种回收率较低的原因可能与实验过程中使用的酸不足以完全抑制所有酶的活性,从而造成DMTS在血液中的快速降解,另外一种可能是血液中更多的疏水成分会干扰搅拌棒的聚二甲基硅氧烷(PDMS)涂层。尽管如此,对于检测限为60nmol/L来说,足够满足检测的要求。经过方法学验证和实际样品分析,该法显示了简便、检出限低等优势,相关线性和相对标准偏差均能取得很好的效果。稳定性的研究表明,血液样本加酸及内标物后应尽快提取和分析,否则需再加入内标物存储于-80℃,冷冻样品解冻后,应立即准备和提取。除此之外,血液中DMTS的分析还可选用有机溶剂萃取作为样品的前处理技术[26-28],但新鲜血液的加标回收率明显偏低的现象不容忽视,且需要进一步研究[28]。Kiss等[29]则探索了集样品萃取、富集和进样为一体的固相微萃取(SPME)为前处理手段,建立了GC-MS大脑中DMTS的检测方法,这些研究均为DMTS的药物代谢动力学等相关研究提供了有力技术支持。

5 DMTS血液药代动力学分析

Silva等[26]建立了环己酮萃取,检测血液DMTS浓度的高效液相色谱-紫外吸收光谱法。提取溶剂环己酮的提取效率研究提示脂水分配系数为3.7,高效液相色谱图提示DMTS的保留时间为9.5min,最低检出限0.010mg/ml,在0.04~0.30mg/ml的浓度范围内线性良好(R2=0.9994)。用15%PS80配制50mg/mlDMTS溶液,以20mg/kg·bw的剂量静脉注射于雄性大鼠体内,分别于注射后0、15、60、90、120和240min收集血液样本1200μl,离心分离红细胞,经环己酮萃取,高效液相色谱-紫外吸收法检测有机相DMTS浓度,绘制血液中DMTS半衰期图。结果发现DMTS主要存在于红细胞和血浆中,其中红细胞中的DMTS浓度是血浆的6.3倍,建议后续研究应以红细胞作为研究基质。在此实验条件下,DMTS在血液中半衰期约为36min,此研究不仅揭示DMTS在血液中有较长的停留时间,还为拮抗氰化物合理时间间隔提供依据。

6 DMTS通过血脑屏障的渗透性

众所周知,脑是氰化物的主要靶器官之一,但血脑屏障(BBB)特殊结构成为中枢神经系统疾病药物治疗的一道障碍。在药物研发过程中,平行人工膜渗透模型(PAMPA)已成为研究药物通过生物膜吸收的理想工具。Kiss等[27]就运用PAMPA和脑细胞共培养技术测量DMTS通过BBB的渗透性,实验结果为DMTS对PAMPA的表观渗透系数为11.8×10-6cm/s,对细胞培养的表观渗透系数为158×10-6cm/s,且对细胞和细胞屏障的完整性没有任何影响,可见DMTS通过BBB-PAMPA的被动扩散速率是显著的。而DMTS在BBB细胞培养模型的渗透系数较BBB-PAMPA高达13倍,揭示DMTS在BBB生物系统中存在主动运输机制。小鼠动物实验模型中(血液和大脑)的药代动力学研究的结果与体外实验一致:肌内注射DMTS后5min吸收入血,10min 即渗透到小鼠的脑组织。DMTS体外血脑屏障渗透性及其在血液和脑组织体内的药代动力学特性显示DMTS成为氰化物中毒的大脑保护性解毒剂的理想药物应用前景。

7 DMTS毒性副作

DMTS在氰化物转化为毒性较低的硫氰酸盐的过程中起硫供体的作用。Dong等[30]报告了与DMTS反应时血红蛋白吸收光谱的变化,这些变化与已知的高铁血红蛋白形成剂亚硝酸钠诱导的变化非常相似,而DMTS形成高铁血红蛋白的动力学较亚硝酸钠慢。因此,作为被规定允许用于调味料及汤汁的一种食用香料,属于一般公认的安全类添加剂(GRAS),但治疗性DMTS将血红蛋白氧化为高铁血红蛋白的潜在副反应需给予重视和必要的监测[31]

8 结语

DMTS广泛存在于天然植物中,作为有机硫供体对氰化物有着明显的解毒效果,特别是大规模伤亡救治中,肌肉注射DMTS相比当前使用的需静脉注射的氰化物解毒剂具有作用迅速且更易给药的优势,因而可能成为新一代氰化物解毒剂。鉴于DMTS可能存在的药物不良反应,其剂型的改进以及临床应用的安全性有待进一步研究。

参考文献(略)

文章来自陈旭,佘仁东,陆荣柱,李芳,王强,寿勇明,张叶,王苏华.新型氰化物中毒解毒剂二甲基三硫研究进展[J].毒理学杂志,2019,33(01):66-69.  10.16421/j.cnki.1002-3127.2019.01.012


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