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.敌草快免疫毒性研究进展

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敌草快(diquat,DQ),化学名称为1,1'- 亚乙基-2,2'- 联吡啶阳离子或二溴盐,分子式为C12H10Br2N2,与百草枯(paraquat,PQ)同属联吡啶类除草剂,被用作接触干燥剂和采前干燥剂来控制陆地和水生植被,可以通过消化道、呼吸道、皮肤黏膜接触等途径吸收,在脾脏中分布最高,在肾脏中次之。其急性中毒的主要临床表现为消化系统、呼吸系统、循环系统、泌尿系统、中枢神经系统等多系统脏器损伤[1]。自2016年7月我国禁用PQ以来,DQ中毒发病率呈逐年升高趋势[2],急性DQ中毒已成为我国急诊较常见的急危重症。虽然DQ的毒性仅被列为中等毒性,但其病死率仍然很高,口服剂量超过50mL的患者预后很差[2-3]。目前,DQ的中毒机制尚不明确,也无特效解毒剂。现有研究表明DQ中毒可能与炎症反应、氧自由基损伤、氧化/抗氧化失衡、细胞的网络激活以及诱导细胞凋亡等机制相关。临床治疗常延用PQ中毒的治疗方案,包括早期减少胃肠吸收(洗胃、吸附剂、导泻或灌肠)、促进毒物代谢产物排出(血液灌流或血液透析)、抗氧化、清除炎性介质、补液等联合对症支持治疗[1-2],但治疗效果却不太令人满意。近年来,有一些研究发现可以通过抑制DQ诱导的免疫毒性来减轻炎症反应及氧化应激,从而改善预后,但现在关于糖皮质激素或环磷酰胺等免疫调节剂能否应用于DQ中毒的临床治疗仍具有很大的争议。因此,探讨DQ免疫毒性有利于进一步阐明DQ中毒机制,或可为下一步诊治甚至预后评估等提供理论依据。本文将对目前与DQ 免疫毒性相关的研究进展予以综述。

1 DQ的免疫毒性

免疫毒性即免疫系统对外源物质的毒性反应,包括免疫抑制、超敏反应、自身免疫反应、免疫原性及不良免疫刺激。现有研究证实了PQ的免疫毒性,包括:⑴直接抑制有丝分裂原诱导的淋巴细胞增殖;⑵诱导晚期效应淋巴细胞凋亡并损害免疫记忆;⑶诱导B淋巴细胞凋亡,降低体液免疫应答,选择性地增加或减少免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)、免疫球蛋白G、免疫球蛋白A的水平;⑷降低循环巨噬细胞的吞噬活性和自然杀伤细胞活性;⑸影响免疫细胞分泌细胞因子,如通过上调促Th17细胞分化的白细胞介素(interleukins, IL)-21 和IL-9,使细胞因子基因表达向Th17炎症细胞表型转移,增加促炎细胞因子IL-17的分泌;⑹降低脾脏和胸腺重量,以及减少脾脏细胞[4-7]。目前关于DQ免疫毒性的研究甚少,绝大多数研究表明DQ的潜在毒性源于它通过氧化还原循环过程产生的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)和活性氮簇(reactive nitrogen species,RNS),最终导致炎症反应及氧化应激甚至细胞死亡[1]。Tang 等[8]研究发现氧化应激导致的免疫防御系统受损可能是由功能失调的炎症细胞因子介导的。由此可知,DQ中毒导致的氧化应激及炎症反应或可造成机体免疫系统受损,即DQ也可能具有免疫毒性。

1.1 DQ中毒诱导的炎症反应及氧化应激

近年来,大量研究表明氧化应激通常伴随炎症反应,如过氧化氢诱导的氧化应激显著影响公猪炎症细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、IL-1β、IL-6、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和IL-10 的分泌和表达[8]。而DQ作为一种强氧化剂,能与分子氧产生超氧阴离子自由基,然后生成各种高ROS,如超氧自由基和羟基自由基,随后导致脂质、蛋白质和核酸氧化损伤及DNA 甲基化,故DQ被广泛认为是诱导动物氧化应激模型的有效化学物质[9]。此外,DQ还可以通过降低抗氧化剂的活性、调节仔猪体内细胞因子及促肾上腺皮质激素水平,诱导氧化应激和炎症反应,如DQ中毒降低了仔猪超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性,增加了丙二醛含量,以及显著提高了TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子的含量,降低了IL-4等细胞因子的产生[10]。由上述研究可知,DQ中毒常伴随着氧化应激及炎症反应。

1.2 DQ中毒诱导的炎症反应及氧化应激与免疫

1.2.1 DQ中毒产生的炎症细胞因子与免疫

DQ中毒诱导的炎症反应可导致血清炎性因子如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、TGF-β 和干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的分泌与表达[10-11],而这些炎性因子又可以作为信号分子参与机体的免疫反应。其作用如下:IL-1β可诱导T淋巴细胞和 淋巴细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞和组织细胞的生长和增殖[12]。IL-2是一种T细胞分泌的细胞因子,作用于表达其高亲和力受体(IL-2Rα、CD25)的细胞,参与T 细胞分化、B细胞发育及激活自然杀伤细胞,在淋巴细胞的生长和增殖中起着至关重要的作用。Liu等[5]研究表明芹菜素可以通过降低IL-2水平并逆转对T细胞增殖的抑制而防止脾脏CD4+和CD8+T细胞减少,减轻PQ免疫毒性。IL-12也是一个关键的参与调节细胞免疫和体液免疫的前体炎症因子,在保护宿主免受病原体入侵方面发挥重要作用。IL-12驱动幼稚的CD4+T细胞,也称为Th0细胞(辅助性T细胞)分化为Th1细胞,而不是Th2细胞[13]。TGF-β是一组多用途肽信号分子,参与调节抗原呈递、T细胞的增殖,促进调节性T 细胞(regulatory cells,Tregs)的分化与发育及抑制Th1和Th2分化,在人体免疫系统中起着独特而关键的作用。TGF-β也可以与TNF-α、IL-1β、IL-6协同促进Th17细胞的发育[14-15]。IFN-γ是一种具有抗病毒活性的细胞因子,通过激活巨噬细胞来恢复吞噬体的激活和增强自噬,在抵抗许多外来病原体中发挥重要作用[13]。IL-4是Th2细胞增殖和活化所必需的抗炎细胞因子,而IFN-γ/IL-4的比值通常被认为是Th1/Th2的指标[11]。以上研究均表明DQ中毒诱导的炎症反应所产生的炎性因子可影响机体的免疫系统,现有研究也证实了DQ中毒后能抑制T淋巴细胞的增殖和活化,降低CD4/CD8比值,增加Th1/Th2比值。

Th1/Th2细胞因子的平衡与DQ中毒后疾病演变进程息息相关,其中Th1和Th2分别参与细胞和体液免疫。Th1极化免疫反应的特征是Th1细胞分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12, 而Th2免疫反应则产生高水平的IL-4、IL-10和IL-13,参与过敏原特异性IgE产生、肥大细胞活化、嗜酸性粒细胞募集和气道高反应性等,其中IL-4和IL-13可以促进免疫球蛋白G4的类转换[11,13,16]。众所周知,Th1/Th2在体内通常保持动态平衡,以维持良好的免疫功能,而DQ中毒后该平衡被打破。Deng等[11]研究发现茶多酚能促进T淋巴细胞的增殖和活化,增加CD4/CD8比值,降低IFN-γ/IL-4比值,使促炎性Th1免疫反应向强抗炎性Th2免疫反应转移,以募集Tregs到受损部位而减轻DQ中毒引起的病理性炎症。其他研究也证实Th1和Th2细胞因子的平衡在炎症、变应性和感染性过程以及移植排斥反应、调节适应性免疫反应中起着重要作用,而控制Th1/Th2细胞因子平衡可以预防免疫介导的疾病[17-18]。由上述研究可

知,调节Th1/Th2细胞因子的平衡及减轻DQ免疫毒性有利于改善DQ中毒的预后。

1.2.2 DQ诱导的氧化应激与免疫

DQ中毒导致过量的ROS产生并诱导氧化应激,ROS生成上调可以导致钙调节失衡、线粒体功能障碍,激活核因子-κB(nuclear-factor kappaB,NF-κB) 信号通路并促进炎性因子(TNF-α、IL-1β 和IL-6)的分泌,最终导致凋亡级联激活,同时促炎细胞因子的过度表达和细胞凋亡也可诱导NF-κB表达,其中NF-κB具有调节免疫反应、炎症、细胞分化、增殖和凋亡相关基因的转录的作用[19]。研究证实ROS也是控制先天免疫表型差异调节的关键因素,如ROS参与Toll样受体依赖性的NF-κB激活。已有研究表明,包括三丁基锡和铅在内的有毒物质可以通过氧化应激而激活NF-κB信号通路及促进炎症因子的表达来影响免疫反应,如抑制免疫反应和调节免疫相关基因(包括IL-10、IL-1β、IL-6、TNF-α、溶菌酶、IgM和热休克蛋白70)的表达[12,20]。此外,Sohrabi等[21]研究发现氧化应激可作为调节巨噬细胞炎症启动的关键,如显著增加促炎性M1巨噬细胞,但不减少抗炎性M2巨噬细胞。Zhong等[22]研究表明由热灭活草分枝杆菌诱导的免疫增强与抗氧化能力的提高相关。由上述研究可知,DQ中毒诱导的氧化应激可能会损害免疫系统,如抑制免疫反应、影响循环巨噬细胞的活性及免疫细胞分泌细胞因子等,增加机体的抗氧化能力有利于减轻免疫损伤,但其具体机制有待进一步探究。

1.2.3 DQ中毒所致的炎症反应及氧化应激与脾脏

动物免疫器官正常的结构和功能与免疫相关,而氧化应激引起的氧化损伤通常会导致许多器官的结构和功能发生改变,如DQ中毒对大鼠的免疫器官肝脏和脾脏都造成了氧化损伤,从而影响大鼠正常的免疫功能。脾作为最重要的外周免疫器官之一,主要负责制造抗体、分化B细胞、调节免疫反应、过滤老化的红细胞、储存血液以及引发对血液所携带抗原的免疫反应。同时脾脏作为网状内皮系统的主要组成部分,是促炎和抗炎细胞因子的主要来源。除此之外,最近研究发现脾脏是迷走神经控制炎症细胞因子产生及调节淋巴细胞活性的靶器官,如刺激迷走神经可增加脾脏三叶因子2的表达,从而减少脾脏骨髓源性抑制细胞的数量、增加脾脏CD8+T的细胞活性,刺激迷走神经也可抑制脾脏p65NF-κB的活化及其下游促炎细胞因子表达[23-25]。由此可见,脾脏可以参与DQ中毒导致的炎症反应、氧化应激以及其诱导的免疫功能损伤。现有研究也证实可以通过改善DQ中毒后脾脏的抗氧化能力以及减少脾脏中炎性因子的表达来减少脾细胞凋亡,进而增强免疫功能。具体机制可能是由于:DQ中毒后导致过量的ROS及大量的炎性因子生成,一方面,脾脏本身具有清除ROS的能力;另一方面,膳食中补充精氨酸一是可能通过上调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)表达及下调Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein1,Keap1)表达而增强脾脏中的核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)的表达,从而增强酶促抗氧化系统和非酶促抗氧化系统的活性、改善肝脏和脾脏的抗氧化状态;二是可能通过降低脾中诱导型一氧化氮合酶的表达以及上调mTOR表达来降低氧化应激状态下大鼠脾脏中IL-1β和TNF-α的分泌;三是可能通过影响脾NF-κB的表达而降低氧化应激下caspase-3的水平,从而减少脾细胞的凋亡,以及上调脾脏TGF-β的表达,最终增强免疫功能[15,25]

2 DQ中毒治疗新思路

DQ中毒目前尚无特效解毒剂,与PQ中毒相比,DQ中毒后肺纤维化发生率较低而肝肾损害较高,这与PQ主要蓄积在肺脏而DQ主要蓄积在肝、肾相关。所以在目前临床治疗中,部分人认为PQ中毒时以防止肺纤维化为主的综合治疗措施,而DQ中毒时则以保护肝肾功能为主的综合治疗措施[26-27]。虽然DQ中毒对肺的损伤弱于PQ中毒,但也有部分文献报道DQ中毒可致肺渗出或肺纤维化(不能除外DQ与PQ混杂中毒所致),使用大剂量糖皮质激素可以减轻其肺渗出或肺纤维化[28-29],而我国现有专家共识不推荐应用免疫抑制剂和大剂量糖皮质激素治疗急性DQ中毒[30]。其实,糖皮质激素除了抗炎,减轻肺渗出或肺纤维化之外,还具有免疫调节作用。现有研究也发现加用免疫调节剂来提高机体免疫力,可以减轻DQ中毒诱导的炎症反应及氧化损。目前关于DQ中毒免疫方面的实验仍处于动物实验阶段而未进入临床前阶段,且有一些具体的机制尚未明确,尚不能用于指导临床治疗方案的制定,故目前关于DQ中毒时是否加用糖皮质激素、环磷酰胺或其他的免疫调节剂仍具很大争议,有待进一步研究明确。

现有动物实验表明,可以通过减轻DQ中毒诱导的炎症反应、氧化损伤以及提高机体免疫力,改善DQ中毒预后。如Deng等[11]研究发现茶多酚可通过抑制IL-1诱导的NF-κB信号通路激活,减少Th1细胞因子IFN-γ的分泌,促使Th1向Th2的免疫转移,从而减轻DQ中毒损伤。Xu等[31]研究发现壳聚糖既能显著降低DQ中毒后仔猪血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平,增加抗氧化酶的活性并降低丙二醛含量,又可以降低仔猪血清中皮质醇含量,减轻DQ诱导的免疫抑制,提高免疫功能,最终减轻DQ中毒损伤。Li等[32]研究表明虾青素可通过抑制肝、脾NF-κB信号通路,使TNF-α、IL-1β 和IL-8促炎细胞因子水平降低,进而抑制T细胞和B细胞的活化、增殖、分化,减轻DQ中毒损伤。Mo等[15]研究发现氨基甲酰谷氨酸或精氨酸既可以通过提高DQ中毒大鼠脾脏的抗氧化能力,从而减少脾脏促炎细胞因子的表达,又可以明显增加TGF-β及caspase-3在脾脏中的转录,增强脾脏免疫功能,最终减轻DQ病理性损伤。

3 结语

DQ中毒导致的氧化应激及炎症反应会影响动物的免疫系统,而动物免疫系统产生的免疫反应又会反过来影响氧化应激及炎症反应过程。且在动物实验中,药物干预既可通过减轻DQ诱导的氧化应激及炎症反应来提高机体的免疫能力,又可通过提高机体的免疫能力来减轻氧化应激及炎症反应,从而改善DQ中毒预后。由此可见,氧化应激、炎症反应及免疫毒性三者之间相互关联,相互影响,但其中一些具体的机制仍有待进一步研究,以期进一步明确DQ中毒的机制,为DQ中毒的系统化、规范化治疗提供合理的理论依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献(略)

文章来自:张炉英,陆元兰,岑祥莹,宋仁杰,张天喜,喻安永,谢智慧,胡杰.敌草快免疫毒性研究进展[J].中华急诊医学杂志,2021,30(5):646-650. DOI号:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2021.05.027

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