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尸检分析揭示百草枯人类中毒中去污,抗炎和免疫抑制疗法的功效差

时间:2017-05-23 23:17来源:https://doi.org/10.1371/journa 作者:admin 点击:
背景 百草枯(PQ)自身中毒造成的死亡是这种除草剂的主要负担。 已经采取了具体的治疗方法来中断其毒性途径,即去污措施以防止PQ吸收并增加其从生物体的排泄,以及施用抗炎和免

尸检分析揭示百草枯人类中毒中去污,抗炎和免疫抑制疗法的功效差

 

 

 

 


背景

百草枯(PQ)自身中毒造成的死亡是这种除草剂的主要负担。已经采取了具体的治疗方法来中断其毒性途径,即去污措施以防止PQ吸收并增加其从生物体的排泄,以及施用抗炎和免疫抑制药物。到目前为止,人类PQ中毒导致死亡后研究均未评估这些治疗措施与PQ毒代动力学和相关组织病理学病变的关系,这些是本研究的目的。

方法/主要发现

为此,在2008年期间,我们从致命的PQ中毒后的五次法医尸体中收集人体液体和组织。通过气相色谱 - 离子阱质谱法测定PQ水平。结构性炎症损伤通过组织学和免疫组化分析进行评估。心脏血液,尿液,胃和十二指肠壁,肝,肺,肾,心脏和隔膜的样品,即使在中毒后6天也显示出可量化的PQ水平。结构分析显示扩散的坏死区,强烈的巨噬细胞活化和白细胞浸润在所有分析的组织。通过免疫组化可以观察到强核因子κB(NF-κB)活化和胶原沉积过多。

结论/意义

考虑到所有分析组织中观察到的PQ水平和最终导致纤维化的表达性炎症反应,我们得出结论,需要对经常进行的治疗方案进行评估,以提高PQ消除从身体的功效以及减少炎症过程。

介绍

百草枯(PQ)中毒是发病率和死亡率方面最具临床意义的杀虫剂之一[1]急性PQ中毒主要是由于摄入市场上可用的浓缩液体除草剂制剂。PQ毒性的主要靶器官是由于其通过高度发达的多胺吸收系统而对浓度梯度的积累的结果,并且由于其通过剧烈的氧化还原循环产生大量的促氧化反应物质的能力途径[1]死亡主要是由于肺泡上皮细胞(I型和II型肺细胞)和细支气管克拉拉细胞破裂,出血,水肿,低氧血症,炎性细胞浸润到间质和肺泡空间,

鉴于提出的PQ毒性机制,在中毒后不同时间点采取了几项治疗措施,阻碍了毒性途径[4]事实上,在过去50年中,PQ中毒管理策略已经针对:(i)通过减少吸收,通过改变分布或通过强制脱水和炭加强消除血液来改变其毒代动力学血液灌注(CHP),(ii)防止产生活性氧(ROS),即通过去铁胺有效控制铁分布,(iii)通过维持有效水平的抗氧化剂(如维生素E和N)清除ROS - 乙酰半胱氨酸,(iv)修复ROS诱导的损伤,特别是通过施用N-乙酰半胱氨酸来维持有效水平的谷胱甘肽,和(v)通过地塞米松,甲基强的松龙,环磷酰胺和N-乙酰半胱氨酸来减少炎症。最近审查了目前用于管理中毒患者的流程图指南[1]

以前一个人的主要弱点死后与致命的PQ中毒的研究,是PQ的毒代动力学和相应的组织病理学病变之间几乎完全没有相关性[1] 此外,这些研究中没有一个评估了人类死后发现与目前进行的侵略性治疗之间的相关性,以评估其在预期药理作用方面的功效。为了提供关于目前使用的治疗流程图的罢工效率的新见解,我们对在法国医学研究所葡萄牙北部分部进行的五次法医尸体解剖收集的流体和组织进行组织学和毒理学分析-NILM)。

材料和方法

道德声明

所有研究都得到了国家生命科学伦理委员会(CNECV)的批准。根据目前的葡萄牙医学法律解剖法,并遵循赫尔辛基宣言的道德原则,对常规收集组织的科学研究不需要受害者家属的书面或口头同意书[5]因此,法律规定,除了确定死因之外,还要取得样本。

化学制品

PQ(1,1'-二甲基-4,4'-联吡啶鎓二氯化物;分子量= 257.2g / mol),乙基百草枯二溴化物(EPQ,1,1'-二乙基-4,4'-联吡啶鎓二溴化物;分子质量= 374.11g / mol),硼氢化钠(NaBH 4),Mayer's苏木精溶液,曙红Y二钠盐,Weigert's铁苏木精溶液,van Gieson溶液酸性品红,SIGMAFAST®Fast Red TR /萘酚AS-MX片剂和邻苯二甲酸二正丁酯聚苯乙烯 - 二甲苯(DPX)安装介质从Sigma(St.Louis,MO,USA)获得。来自Santa Cruz Biotechnology Inc的NF-κBp50(NLS)兔多克隆抗体(SC-114)和与碱性磷酸酶(SC-3838)缀合的第二抗免疫球蛋白山羊抗兔IgG,F(ab')2 。,加利福尼亚,美国。Aquatex®,甲醇(HPLC级),Na 2 HPO 4(无水),KH 2 PO 4(无水),NaCl,KCl均得自Merck(Darmstadt,Germany)。所有使用的试剂均为分析级或最高级别。

病例报告和尸检

本研究共纳入了5例人体致死性心脏病患者(4名男性和1名女性,年龄在56-62岁之间)。在病人到医院急诊部门怀疑有毒副作用,随后使用碱和连二亚硫酸钠显色试剂通过尿样进行现场试验证实。登记了有关摄入量PQ配方和所进行的治疗措施受害者的数据。死亡发生在接触后9小时至6天的间隔。尸体维持在2-3°C直到自动检查。死亡后1-3天,进行尸体解剖,收集心脏血液,尿液,肺,肝,肾,心脏,隔膜,十二指肠和胃壁样品。

百草枯量化的组织加工

将肺,肾,肝,心脏,隔膜,十二指肠和胃壁样品在冰冷的去离子水中匀浆(1:4m / v,Ultra-Turrax均质器)。将匀浆保持在冰上,然后离心以3000 ,4℃,10分钟。将所得上清液的等分试样储存(-80℃)用于后PQ定量。心脏血液和尿液样品直接进行PQ提取程序。

百草枯从生物样品中提取

根据de Almeida和Yonamine [6]进行了轻微改性的生物样品的PQ 提取。简言之,将0.5mL的每种含水上清液,尿液和血液样品,1.5mL磷酸盐缓冲盐水溶液(pH8.0)和20μLEPQ溶液(100μg/ mL)的等分试样移入15mL塑料管中,螺丝帽。向该溶液中加入10毫克硼氢化钠(NaBH 4)。将反应混合物在60℃保持10分钟。对于固相萃取(SPE),用2mL甲醇和2mL磷酸盐缓冲盐水溶液(pH8.0)对C18(Bond Elut C18,床重量为1mL,Varian)柱)进行预处理。将样品溶液转移到筒中,并用2mL去离子水进一步洗涤。之后,用2mL甲醇进行PQ的洗脱,并在温和的氮气流下在室温下蒸发洗脱液。将残余物重新配成100μL甲醇,1μL注入气相色谱 - 离子阱质谱(GC-IT-MS)仪器中。

气相色谱 - 离子阱质谱条件

使用装备有VARIAN Saturn 4000质量选择性检测器(USA)和Saturn GC / MS工作站软件6.8版的Varian CP-3800气相色谱仪(USA)进行PQ的GC-IT-MS分析。使用来自VARIAN的色谱柱VF-5ms(30m×0.25mm id×0.25μm膜厚)。注射器端口被加热到250℃并且以不分流模式操作。载气为氦气(Gasin,Portugal),以1.0 mL / min计,恒流。烘箱温度为80℃(1分钟),然后以2℃/分钟升至270℃并保持20分钟。所有质谱在全扫描模式下通过电子轰击(EI,70eV)获得。在最初的2分钟期间电离被维持,以避免溶剂过载。离子阱检测器设置如下:传输线,歧管和捕集阱温度分别为280,50和180℃。质量范围为50?600m / z,扫描速度为6扫描/秒。发射电流为50μA,电子倍增器设置为自动调谐过程的相对模式。最大电离时间为25000μsec,电离储存水平为35m / z通过使用每种化合物的特定离子重新构建全扫描色谱(FSC)来确定PQ和EPQ的色谱峰面积。选择离子监测色谱图(SIMC)。选择用于每个化合物中的离子为: / ? 134,148192(PQ)和 / ? 148,162,220(EPQ)。下划线离子用于定量。发射电流为50μA,电子倍增器设置为自动调谐过程的相对模式。最大电离时间为25000μsec,电离储存水平为35m / z通过使用每种化合物的特定离子重新构建全扫描色谱(FSC)来确定PQ和EPQ的色谱峰面积。选择离子监测色谱图(SIMC)。选择用于每个化合物中的离子为: / ? 134,148192(PQ)和 / ? 148,162,220(EPQ)。下划线离子用于定量。发射电流为50μA,电子倍增器设置为自动调谐过程的相对模式。最大电离时间为25000μsec,电离储存水平为35m / z通过使用每种化合物的特定离子重新构建全扫描色谱(FSC)来确定PQ和EPQ的色谱峰面积。选择离子监测色谱图(SIMC)。选择用于每个化合物中的离子为: / ? 134,148192(PQ)和 / ? 148,162,220(EPQ)。下划线离子用于定量。最大电离时间为25000μsec,电离储存水平为35m / z通过使用每种化合物的特定离子重新构建全扫描色谱(FSC)来确定PQ和EPQ的色谱峰面积。选择离子监测色谱图(SIMC)。选择用于每个化合物中的离子为: / ? 134,148192(PQ)和 / ? 148,162,220(EPQ)。下划线离子用于定量。最大电离时间为25000μsec,电离储存水平为35m / z通过使用每种化合物的特定离子重新构建全扫描色谱(FSC)来确定PQ和EPQ的色谱峰面积。选择离子监测色谱图(SIMC)。选择用于每个化合物中的离子为: / ? 134,148192(PQ)和 / ? 148,162,220(EPQ)。下划线离子用于定量。通过使用每种化合物的特定离子重新构建全扫描色谱(FSC)来确定PQ和EPQ的区域。选择离子监测色谱图(SIMC)。选择用于每个化合物中的离子为: 米 / ? 134,148192(PQ)和 / ? 148,162,220(EPQ)。下划线离子用于定量。通过使用每种化合物的特定离子重新构建全扫描色谱(FSC)来确定PQ和EPQ的区域。选择离子监测色谱图(SIMC)。选择用于每个化合物中的离子为: 米 / ? 134,148192(PQ)和 / ? 148,162,220(EPQ)。下划线离子用于定量。

组织结构分析处理

肺,肾,肝,心脏,隔膜,十二指肠和胃壁样本均进行定性结构分析的常规组织学程序。简言之,在24小时内通过扩散固定[4%(v / v)缓冲甲醛]立方块,随后用分级乙醇脱水并包含在石蜡块中。苯用于脱水和浸渍之间的过渡。通过切片机切割石蜡块的连续切片(4μm),并安装在硅烷涂覆的载玻片上。

染色程序

将载玻片在二甲苯中脱蜡,并通过溶解Na 2 HPO 4(1.44g),KH 2 PO 4(0.24g),NaCl(8g),KCl(0.2g)和调节pH值制备的磷酸盐缓冲盐水溶液中的分级醇进行水合至7.2。对石蜡切片染色苏木精 - 伊红和van Gieson方案,进行免疫组织化学NF-κB分析,相应于以前描述的研究[7][8]简言之,苏木精苏木精溶液浸渍载玻片进行苏木精 - 伊红染色3-4分钟,然后浸入1%曙红溶液中7分钟,用二级甲醇进行脱水,并用DPX装入。van Gieson染色[9][10]应用于评估胶原沉积。将滑块浸入Weigert的苏木精溶液中20分钟,在自来水中洗涤1分钟,在酸性乙醇(1%HCl,70%乙醇中)分离5秒钟以上,再次在自来水中洗涤5分钟,在蒸馏水中漂洗将水浸在van Gieson的污渍中1小时。最后,将载玻片在蒸馏水中快速漂洗,然后在100%乙醇中清洗,并装入DPX中。胶原纤维通过红色染色证实。为了进行NF-κB免疫组织化学检测,将NF-κBp50兔多克隆抗体应用于脱蜡肝切片,并将这些样品在37℃下在加湿室中孵育2小时。然后将样品与第二抗免疫球蛋白山羊抗兔IgG,F(ab' )2与碱性磷酸酶缀合,在相同条件下1小时。根据制造商的说明书,将SIGMAFAST®Fast Red TR /萘酚AS-MX片剂用作底物。这些部分用Mayer的苏木精复染。用磷酸盐缓冲盐水溶液代替一级抗体用于阴性对照区段。使用Aquatex将所有染色的切片安装在载玻片上。使用光学显微镜Carl Zeiss - Axio Imager。使用Aquatex将所有染色的切片安装在载玻片上。使用光学显微镜Carl Zeiss - Axio Imager。使用Aquatex将所有染色的切片安装在载玻片上。使用光学显微镜Carl Zeiss - Axio Imager。

考虑到样本量小,PQ摄入剂量的异质性和入选患者中毒后的存活变异性无统计学意义。

结果

临床,人口统计学和自动数据

据临床报道,参与本研究的所有受害者均发烧,干咳和进行性呼吸困难。关于治疗措施,所有受害者均受到相同的方案,它们之间的差异是PQ的血浆浓度和存活期。进行活性炭灌胃和七次CHP(每次8小时)。对于以下方案,还进行了进一步的治疗措施:(i)环氧磷酰胺,在100mg 5%右旋糖溶液中的15mg / Kg,60分钟内灌注,CHP后每天一次,住院前两天; (ii)在60分钟内灌注的200ml 5%右旋糖溶液中的15mg / Kg的甲基泼尼松龙,并且每天重复一次,连续三次,始终在CHP后; (iii)去铁胺,100毫克/公斤在500毫升5%葡萄糖溶液中,连续灌注,21毫升/小时,24小时内,一次给药开始后第一次CHP期间; (ⅳ)维生素E,300mg的口服,每日两次,CHP后; (v)N-乙酰半胱氨酸(NAC)在第一次CHP会话后以150mg / Kg的剂量在500mL的5%葡萄糖溶液中灌注,在3小时内灌注; 随后,在3mL的时间内,以连续灌注21mL / h,在500mL的5%葡萄糖溶液中以300mg / Kg给予N-乙酰半胱氨酸。3天后,甲泼尼龙停药,每8小时接受静脉注射地塞米松5 mg。此外,每位患者接受应激性溃疡预防(奥美拉唑40 mg IV

表一显示与人口统计学相关的中毒案例数据,摄入体积(mL),体重,器官重量,主要宏观病理学发现和中毒后生存期。中毒患者的平均年龄为58.6±2.2岁。由于临床报告记录了以前与酒精消耗相关的病理学和长时间使用非甾体抗炎药物的临床报告,因此,除第三次报告的胃炎患者观察到胃炎,但与PQ中毒没有关系的情况下,胃镜检查未发现胃肠道溃疡。炎症药物。在肺中发现最突出的宏观发现,其显示出纤维化的迹象和由于水肿引起的体重增加(图1A和1B)。肺部出现子宫内出血。在所有情况下,肾脏和肝脏均明显改变,黄疸(表面和切面均为黄色)和出血。在情况1中,在器官中观察到绿色蓝色,对应于快速致命的PQ中毒( 图1C和1D)。在所有情况下都没有感染证据。一些变量关联可以从表1给出的结果推断出来如预期,生存期与摄入量成反比。随着生存期,肺重量似乎增加,而肝脏和心脏重量似乎随着生存期的增加而减少。肾脏重量无明显变化。在情况1中,在器官中观察到绿色蓝色,对应于快速致命的PQ中毒( 图1C和1D)。在所有情况下都没有感染证据。一些变量关联可以从表1给出的结果推断出来如预期,生存期与摄入量成反比。随着生存期,肺重量似乎增加,而肝脏和心脏重量似乎随着生存期的增加而减少。肾脏重量无明显变化。在情况1中,在器官中观察到绿色蓝色,对应于快速致命的PQ中毒( 图1C和1D)。在所有情况下都没有感染证据。一些变量关联可以从表1给出的结果推断出来如预期,生存期与摄入量成反比。随着生存期,肺重量似乎增加,而肝脏和心脏重量似乎随着生存期的增加而减少。肾脏重量无明显变化。一些变量关联可以从表1中给出的结果推断出来。如预期,生存期与摄入量成反比。随着生存期,肺重量似乎增加,而肝脏和心脏重量似乎随着生存期的增加而减少。肾脏重量无明显变化。一些变量关联可以从表1中给出的结果推断出来。如预期,生存期与摄入量成反比。随着生存期,肺重量似乎增加,而肝脏和心脏重量似乎随着生存期的增加而减少。肾脏重量无明显变化。

缩略图
 
图1.自动宏观光记录。

 

A:病例5的肺纤维化 B:肺水肿病例4; C和D:情况1的胃肠器官的绿蓝色外观。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007149.g001

缩略图
 
表1.百草枯中毒致死受害者的人口统计数据及相关临床,自体和病理形态学发现。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007149.t001

组织病理学分析

主要肺定性结构改变如图2所示肺部显示出明显的肺泡壁塌陷和肺泡壁增大(图2A),显然由明显的血管充血,间质性水肿和胶原蛋白沉积所解释,在4和6天生存受害者中由van Gieson染色证明。特别证明了几个肺泡的汇合。还有观察到的内分泌弥漫性凝血的迹象,由纤维蛋白样沉积物中被捕获的红细胞和白细胞的存在表明。在肺泡空间和壁中的所有受试者中观察到许多巨噬细胞样细胞(图2C)和多形核和单核白细胞的浸润。增稠,破裂,或肺泡壁坏死和肺细胞脱屑也特别臭名昭着。在所有观察到的情况下 ,也注意到大量血管壁内广泛分散的炭疽色素沉积( 图2B)。

缩略图
 
图2.用苏木精 - 伊红(A-C)染色的百草枯人致命中毒的肺的光照片和NF-κB(D)的免疫组织化学分析。

 

在A中,显示出肺泡塌陷,几个肺泡汇合,血管充血(*),肺泡壁扩大与白细胞浸润(#),肺泡出血和巨噬细胞样细胞,以及肺泡空间内的白细胞。在B中,描述了大型血管壁(蓝色箭头)中炭疽色素的积累。在C中,观察到血管充血,肺泡内的纤维蛋白样沉积物捕获红细胞,白细胞和巨噬细胞样细胞(绿色箭头)。在D中,NF-κB活化在巨噬细胞样细胞中是明显的(绿色箭头D)。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007149.g002

主要肝脏定性结构改变如图3所示在小叶结构中,具有红细胞捕获在纤维蛋白沉积物中的中心叶正弦曲线的明显增大和围绕正弦曲线的胶原染色增加(图3D)是臭名昭着的,特别是在存活时间更长的受害者中。在门静脉和中心小叶区域的强化胶原蛋白沉积导致主要血管狭窄。在单个核细胞和成纤维细胞的浸润在主要血管壁是明显的。还观察到在门静脉周围附近的大泡泡沫化和分散的微泡空泡化(图3A和3B)。组织学也显示广泛的细胞内黄棕色沉积物(图。

缩略图
 
图3.用苏木精 - 曙红(A-C)和van Gieson(D)染色的百草枯人致命中毒的肝脏的光照片。

 

在A中,存在于纤维蛋白沉积物中的具有红细胞的中心小叶正弦曲线明显增大; 扩大大血管壁,完全阻塞中心静脉(红色箭头); 门静脉肝细胞的巨囊泡空泡(#)也是显而易见的。在B中,在门静脉肝细胞中显示出大泡(#)和微泡空泡化。在C中观察到近中心区域,广泛的细胞内黄棕色沉积物,细胞坏死与扩大的正弦空间内的许多细胞碎片。在D中,观察到围绕periportal和正弦空间(蓝色箭头)的密集胶原沉积; 在门静脉区域,即成纤维细胞样细胞和单核白细胞中细胞密度的增加也是臭名昭着的。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007149.g003

主要的肾脏定性结构改变如图4所示观察到标记的间质性出血(图4A和4B)和间质空间和周围大血管中的胶原沉积。组织学还显示肾小管细胞坏死,即近端小管。肾脏显示血管壁和Bowman胶囊顶层增厚,肾小球全球坏死被纤维样样沉积物代替。发生间质性水肿,血管充血和细胞浸润到肾小体附近的间质也是明显的(图4C)。

缩略图
 
图4.用苏木精 - 伊红(A-C)染色的百草枯人致命中毒的肾脏的光照片和NF-κB(D)的免疫组织化学分析。

 

在A和B中,观察到肾小球和肾小球外空间内有明显的血管充血(*); 还描绘了肾小球的凝血坏死(红色箭头)。组织学还揭示了肾小管细胞广泛的坏死,影响更密集的近端受精小管。在C中,毛细血管内单核细胞(#)的显着密度也渗透组织。在D中,NF-κB活化被广泛化,但在管状远端回旋小管(蓝色箭头)中特别更加密集。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007149.g004

主要的胃十二指肠壁结构变化分别如图5A-B和5C-D所示。特别是观察到粘膜结构的丧失,坏死粘膜下水肿和上皮脱屑。在绒毛内检测到融合的半透明区域,并与隐窝相邻。胶原沉积异常和单核细胞聚集也是臭名昭着的。也注意到拥堵和出血区域。

缩略图
 
图5.用苏木精 - 伊红染色的百草枯人致命中毒的胃(A和B)和十二指肠(C和D)壁的光照片。

 

在A和B中,观察到单核细胞脱屑和粘膜浸润的上皮细胞坏死(#)。还有粘膜下水肿(*)。在C和D中,上皮坏死影响绒毛和隐窝,丧失粘膜绒毛结构,单核细胞浸润(绿色箭头),血管充血(红色箭头),粘膜和粘膜下水肿特别臭名昭着。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007149.g005

主要隔膜和心脏定性结构变化如图6所示心脏检查发现间质性水肿,局部出血性浸润和毛细血管内许多边缘化白细胞的区域。还观察到在核周区附近的细胞内黄褐色沉积物,血管充血和坏死性重点影响少量细胞。关于隔膜,还观察到血管充血,间质性水肿,核周黄色 - 棕色沉积物,强化的肌浆液泡化和许多具有中央核的纤维。

缩略图
 
图6.用苏木精 - 伊红染色的百草枯人致命中毒的隔膜(A和B)和心脏(C和D)的光照片。

 

在A和B中,肌肉纤维中观察到间质性水肿(#)和空泡化(绿色箭头)的迹象。在C和D中,主要的微观改变与血管充血(*),间质空间中黄褐色颜料(蓝色箭头)和纤维蛋白样沉积物的积累有关。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007149.g006

免疫组化NF-κB分析

进行免疫组织化学分析,以评估所用抗炎和免疫抑制疗法抵消炎症转录因子NF-κB的活化。所有分析的组织显示活化的NF-κB阳性染色,影响大多数细胞。在肺中,巨噬细胞样细胞中强烈的激活特别臭名昭着(图2D)。管状远端回旋细胞(图4D)显示最强烈的染色。在胃十二指肠粘膜的隐窝细胞内,NF-κB的免疫组织化学染色更为明显。关于剩余的观察组织,NF-κB阳性染色没有显示任何特定的细胞偏爱,器官完全受影响(结果未显示)。

百草枯量化

器官中的百草枯浓度(μg/ g组织),尿液和血液(μg/ mL)死亡后样品在表2中作为每个报告病例的独立结果列出。由于摄入剂量,呕吐体积和存活期的异质性,不计算平均浓度。然而,可以推断出一些有价值的结果:(i)所有分析样本的尸检病例中,肺脏是最高浓度的器官,除了第一种情况,其中尿液浓度最高,这与快速致命性中毒; (ii)肾脏显示随之而来的最高浓度; (iii)心脏表现出最低的PQ浓度;

缩略图
 
表2.器官中百草枯浓度(μg/ g组织),尿液和血液(μg/ mL)收集死后

 

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007149.t002

讨论

根据最近的案例研究,由于农药暴露[11][12][13][14][15][16],PQ负责数以千计的致命中毒事件在葡萄牙最近进行的一项研究中,据估计,在所有法医死亡后农药分析中,有20%至30%是由PQ中毒引起的[17]PQ 于2007年7月11 被欧盟法院禁止不符合卫生标准,因此废除了2003年的批准。然而,在决定之后的12个月内,有可能出售存在于库存中的PQ并将其用于12月尽管有这些新的规定,2008年在葡萄牙,PQ仍然占全部致命病例的10%。在所有情况下,摄入意图是唯一报告使用的中毒途径,维持正确使用安全的双方同意的想法。高死亡率主要是由于缺乏有效的治疗。事实上,关于PQ毒性机制,甚至更少的关于适当的治疗措施,仍然很多。为了了解当前治疗PQ中毒的脆弱性,我们研究了2008年NB-NILM期间PQ中毒的前5名人类受害者。获得的结果揭示了以下治疗未达到生物/生存目标的原因。事实上,消除治疗和针对抵抗炎症过程的治疗都不能有效恢复PQ相关的病理生理改变。不同组织中PQ的死亡后浓度显示,施用的处理不能阻止致死组织的积累。此外,组织学分析显示重要结构变化的严重事件,特别是炎症反应。

参加本研究的受害者的生存期在9小时至6天之间变化,代表致命的急性中毒。组织学,免疫组织化学和毒代动力学发现的严重程度反映了摄入的剂量,尽管吸收的实际量高度依赖于呕吐和/或胃洗液。肺部异常重,如表1所示,充血,充血,充盈并保持胸腔的形状。在第五例中观察到纤维化的宏观症状,其符合生存期。在显微镜下,都显示对van Gieson技术的阳性染色,反映纤维化,但没有足够的延伸对致命结果有显着贡献。看来,超细胞“增殖”阶段,由于肺泡内和肺间质胶原沉积而导致的肺泡结构丧失并不是这些受害者死亡的主要机制。据文献报道,中度中毒随访时间较长,尸检结果显示不同[18]口咽粘膜的变化最终被解决,肝肾通常呈正常的外观,肺部发生剧烈的变化,这表明了众所周知的PQ中毒经典图像。在大体检查中,肺通常尺寸减小,由于纤维化而呈现出坚实的外观,呈现出深灰色。通过显微镜分析,通常观察到具有丰富纤维化的严重异常组织,通常几乎消除了肺泡。在肺泡壁和肺泡空间中可以看到许多丰满的成纤维细胞[18]一般而言,较长的存活时间,更多的标记是在肺泡成纤维细胞增殖,越无气肺组织是,较少炎症通常观察到的[18] 在本研究中包括的致命PQ中毒病例中,这种众所周知的模式并不明显,因为在数小时至数天内观察到所有的死亡,并没有足够的时间进行胶原蛋白的大量合成和沉积。由于血纤维蛋白样沉积物中被捕获的红细胞和白细胞的存在,提示血管充血,在所有受试者的肺泡空间和壁中观察到显示出强的NF-κB活化和多形核和单核白细胞浸润的许多巨噬细胞样细胞。这些发现表明,免疫抑制和抗炎药物不能有效地恢复PQ诱导的肺毒性作用。此外,似乎很明显,抗栓药物应该包含在用于管理PQ中毒的武库中,以避免血管内和肺内凝血。来自组织学的另一个有趣的结果涉及在大肺血管壁和肺泡巨噬细胞样细胞的细胞浆中沉积蒽色素。这种现象以前没有描述过。所有中毒案件均来自半城市地区,没有一名受害者出现了以前的吸烟习俗。我们假设碳颗粒沉积物是由CHP中使用的木炭柱释放的结果,其可以代表该治疗措施的另一个次要作用。体外消除手术的目标是从循环中除去PQ,并阻止其被肺细胞和克拉拉细胞吸收。已经显示有效增强体外消除PQ的唯一方法确实是CHP。大多数毒理学家目前建议快速启动CHP以降低血浆PQ水平,并限制肺部和其他器官摄取PQ。分析了105例吞咽1?3口PQ溶液(24.5%w / v)的患者,Hong et al。 [19]得出结论,足够的CHP似乎是急性PQ中毒患者不可或缺的治疗方法。Okonek 等人 [20][21]提出应该进行“连续”(重复)热电联产。我们研究中包括的受害者在4天内提交了7次会议,每次8小时,当时的生存期允许。尽管在PQ中毒引起的致命结果的回归中CHP疗效有相当多的证据,但是这种疗法的有用性已经成为重大争议的主题,文献中发表的许多证据表明在许多情况下缺乏临床益处[22 ][23]我们的死后研究证实,CHP无法从有机体中完全清除PQ,即使在6天的生存之后,允许七次CH??P。在我们看来,除非程序在早期开始,当PQ集中在中央隔间时,会导致体外技术的全身PQ清晰度差。这可以通过广泛的PQ组织分布来解释,如在本研究中观察到的,并且由于其在体外去除程序终止后缓慢再分配回循环的结果[24]由于PQ浓度升高,CHP完成后数小时可能出现,支持即使在连续CHP存在的情况下,功效也不明确。即使在六天的生存之后,允许七个会话的CHP。在我们看来,除非程序在早期开始,当PQ集中在中央隔间时,会导致体外技术的全身PQ清晰度差。这可以通过广泛的PQ组织分布来解释,如在本研究中观察到的,并且由于其在体外去除程序终止后缓慢再分配回循环的结果[24]由于PQ浓度升高,CHP完成后数小时可能出现,支持即使在连续CHP存在的情况下,功效也不明确。即使在六天的生存之后,允许七个会话的CHP。在我们看来,除非程序在早期开始,当PQ集中在中央隔间时,会导致体外技术的全身PQ清晰度差。这可以通过广泛的PQ组织分布来解释,如在本研究中观察到的,并且由于其在体外去除程序终止后缓慢再分配回循环的结果[24]由于PQ浓度升高,CHP完成后数小时可能出现,支持即使在连续CHP存在的情况下,功效也不明确。将导致体外技术的全身PQ清晰度差。这可以通过广泛的PQ组织分布来解释,如在本研究中观察到的,并且由于其在体外去除程序终止后缓慢再分配回循环的结果[24]由于PQ浓度升高,CHP完成后数小时可能出现,支持即使在连续CHP存在的情况下,功效也不明确。将导致体外技术的全身PQ清晰度差。这可以通过广泛的PQ组织分布来解释,如在本研究中观察到的,并且由于其在体外去除程序终止后缓慢再分配回循环的结果[24]由于PQ浓度升高,CHP完成后数小时可能出现,支持即使在连续CHP存在的情况下,功效也不明确。并且由于在体外去除程序终止后缓慢再分配回循环[24]由于PQ浓度升高,CHP完成后数小时可能出现,支持即使在连续CHP存在的情况下,功效也不明确。并且由于在体外去除程序终止后缓慢再分配回循环[24]由于PQ浓度升高,CHP完成后数小时可能出现,支持即使在连续CHP存在的情况下,功效也不明确。

关于肾结构改变,观察到广泛的炎症细胞浸润区域,坏死,出血和黄疸。免疫组织化学分析显示远端回旋细胞标记的NF-κB活化(图4D)。远端小管相对于近端的NF-κB的显着激活可以通过广泛坏死的几乎完全不存在近端小管来解释。事实上,近端小管似乎受PQ中毒影响更??大,这支持了较低的NF-κB活化能力。Beebeejaun及其同事[25]也通过组织病理学检查发现PQ中毒的致命病例,发现近端肾小管坏死。根据以前报道的研究,PQ主要通过管状过滤和人体活动性管状分泌来消除[26],管状再吸收最小[25]在人类中,如果肾功能保持正常,超过90%的患者在摄入后12至24小时内排泄不变[27]大剂量的PQ摄入会导致肾小管坏死,GFR和管状分泌物迅速减少,从而导致消除半衰期的增加[26][28]肺后,肾脏是证明PQ浓度最高的器官,支持这种途径去除PQ的意义。如果肾功能保持正常,超过90%的患者在摄入后12至24小时内排泄不变[27]大剂量的PQ摄入会导致肾小管坏死,GFR和管状分泌物迅速减少,从而导致消除半衰期的增加[26][28]肺后,肾脏是证明PQ浓度最高的器官,支持这种途径去除PQ的意义。如果肾功能保持正常,超过90%的患者在摄入后12至24小时内排泄不变[27]大剂量的PQ摄入会导致肾小管坏死,GFR和管状分泌物迅速减少,从而导致消除半衰期的增加[26][28]肺后,肾脏是证明PQ浓度最高的器官,支持这种途径去除PQ的意义。

在肝脏中,观察到中心小叶窦状结构的显着增大,并且正弦波周围的胶原染色增加也是臭名昭着的(图3D)。观察到主要肝脏血管明显狭窄,表明该主要代谢器官的灌注受损。肝脏组织学也证明了黄褐色颜料的充分沉积(图3C)。虽然不可能准确地确定出现这些色素的原因,但这一发现可能与胆汁淤积有关,因为肝脏在所有受害者中显示出黄疸。根据13例与PQ中毒相关的肝损伤患者的分析,Mullick et al[29]显示,其中十例患者肝内胆汁排泄途径受损。作者描述了PQ肝毒性的两个阶段,首先是由于PQ的积累并由肝细胞损伤表现出来,第二个特征是与PQ排泄到胆汁或通过肠肝循环的吸收相关的胆管细胞和胆汁淤积性损伤,随后消除胆汁。Takegoshi 等 [30]也显示肝损伤参与急性PQ中毒与肝内胆汁郁积和黄疸,轻度肝细胞坏死。此外,这些作者还观察到肝活检中胆汁排泄途径的损伤。电镜下,在肝细胞中发现胆小管扩张,微绒毛减少和细胞周质内质网增厚[30]其他作者还表明,PQ中毒的肝内胆汁淤积继发于胆管损伤[31][32]这些发现证实了我们的结果,并建议胆汁分泌装置在肝细胞和胆汁上皮细胞可能是PQ的目标。胆道路线似乎代表为PQ排泄的重要途径由于P-糖蛋白(P-gp)的中的肝细胞的小管膜的强表达[33] [34]和PQ已胆汁中被恢复尸检样品[ 35]事实上,P-gp最近被证明是积极参与PQ的运输[36]除了胆道的排泄作用外,这一事实也表明肠内循环应该被认为发生在人体内。肝脏被证明是积累PQ的第三个器官。这可能是由于PQ从肠道中持续吸收,并且可能反映上述肠肝再循环,或者在胃灌洗程序中施用活性炭的相对低效率,以减少肠道对PQ的吸收。在所有情况下,PQ在胃十二指肠粘膜壁中的存在与这些假设一致。

关于我们研究中检查的隔膜标本,都显示出各种变性程度,包括肿胀,交叉条纹变化,血管充血,间质性水肿,核周黄色 - 棕色沉积物,强化的肌浆空泡化和许多纤维与中央核。心脏肌肉证明了类似的损伤模式。组织学检查发现间质性水肿,局部出血性浸润和毛细血管内许多边缘化白细胞的区域。还观察到在核周区域附近的细胞内黄棕色沉积物,血管充血和坏死性重点影响少量细胞,支持该器官未被进行的治疗保护的想法。据报道,与PQ中毒有关的肌病首次出现,由桑德斯和同事在一九八五年[39]Koppel及其同事[40]随后报道,在摄入未知剂量的PQ并在摄入 11 死亡的52岁女性死后肋间肌标本中观察到广泛的坏死。Vyver 等 [41]描述了摄入PQ后5天死亡的患者,其PQ水平在骨骼肌中高,并且在入院后第四天出现血液中肌酐激酶水平的升高。在Sharp 等人进行的大鼠实验中 [42]和Rose 等人 [43]口服PQ治疗后的短时间内,骨骼肌中的浓度低于肺,肾,肝中的浓度。此外,夏普等 [42]报道,PQ的随后半衰期在肌肉中最长(4-5天),尽管血浆和其他组织中PQ的初始半衰期极短(20-30分钟)。他们还报道说,在大鼠中,PQ水平的下降在肌肉中最慢,而肌肉代表了PQ的主要残留池。在本研究中,我们无法评估肌肉的这个储存库行为。在所有病例和心脏中均检测到PQ在四例中,但由于这些病例为急性或亚急性致命性中毒,因此没有足够的时间验证肺,肝,肾中PQ积累的减少以及维持,由于半衰期较长,的肌肉组织中的PQ水平。最近,在致命的人类PQ中毒中也报道了主要是腹直肌,腰大肌和隔膜的骨骼肌变性[44]在以前在大鼠中进行的临床前研究中,在PQ中毒30天后,注意到心肌中胶原沉积的相关结构变化或差异不明显[7]通过不同的实验设计,Noguchi 等人 [45]观察到大量PQ(364mg / kg)给药后不久死亡的大鼠心脏的严重水肿,充血和出血和功能障碍。这些作者认为,在早期暴露阶段,PQ迅速积累在心脏中可能在急性死亡中起重要作用。其他作者在PQ中毒中也报道了有毒心肌炎[46][47][48]Povoa 等人 [49]报道由于PQ引起的心脏毒性是频繁的(40%)。这种参与的临床表现具有广泛的范围,从心电图的最小变化到急性和广泛的心肌坏死。

PQ的众所周知的腐蚀作用是对嘴唇,舌头,口咽,食管,胃和气管粘膜溃疡性病变造成的,特别是严重的中毒[50]口腔多发的梨状溃疡,气管和整个支气管树的坏死性溃疡,以及充足的脓性外观材料的充气气管粘膜,允许观察到后气管壁连续性的断裂,在PQ中通过支气管镜检查观察到中毒患者[51]然而,在本文所述的研究中登记的受害者中没有一个证明是这样的病变。在第三种情况下,观察到胃炎,但与先前与酒精消耗相关的病理学和延长使用非甾体抗炎药物相关。根据间接发现,Gramoxone®被所有受害者摄入。这种配方具有保护措施,即蓝绿色染料,呕吐和气味。因此,在情况1中登记的器官观察到的蓝绿色与PQ制剂有关。

总之,这项研究表明,目前使用的治疗流程图需要改进,因为与PQ暴露有关的积累和损伤既不能有效地恢复。如果成功使用药物治疗来预防临床前和临床试验中的PQ毒性,肯定会有助于降低与该除草剂有关的人类发病率和死亡率。

致谢

来自Cooperativa de Ensino高级政治大学(CESPU)临床分析与公共卫生系的Isabel Costa,DianaFélix和Carina Almeida以及Minho大学医学系的Ana Raquel Dias的热情合作是非常承认

作者贡献

设想和设计实验:RJDO PGdP MdLB FR JD FC。执行实验:RJDO PGdP LS AS FR JD FC。分析数据:RJDO PGdP LS HT TM AS MdLB FR JD FC。贡献试剂/材料/分析工具:RJDO PGdP HT TM AS MdLB FR JD FC。写道:RJDO PGdP LS HT TM AS MdLB FR JD FC。

参考(文献略)


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